大腸桿菌表達實驗標準操作流程(SOP)

實驗原理和目的

原理:將外源基因插入質粒或其他載體,再導入活的宿主細胞,使外源基因高效表達,獲得所需的蛋白質。大腸桿菌蛋白表達原理及IPTG誘導原理詳細內容請訪問:原核表達IPTG誘導原理
下載

實驗試劑

  • 質粒
  • 感受態細胞
  • TE:10mM?Tris-HCl?1mM?EDTA?PH=8.0
  • LB:試管4ml;固體平板
  • 抗性:A+(100mg/ml);???K+(50mg/ml);??CI
  • 保種甘油:C=80%???V=100ml
  • IPTG
  • 1?x?PBS
  • 2?x?Loading?Buffer
  • DDH2O

實驗儀器

  • 冰箱(4℃)
  • 超低溫冰箱(-80℃)
  • 水浴鍋(42℃)
  • 搖床(37℃;195r)
  • 培養箱(37℃)
  • 可見分光光度計(OD600;OD=0.6-0.8)
  • 離心機(6000r/min)
  • 煮樣器(100℃;25min)

詳細實驗步驟

  1. 表達鑒定第一天的任務,常用抗性選擇根據感受態細胞選擇
  • 拿到質粒,離心(3000r/min;2min)
  • 在質粒中加入TE【使質粒最終加入到110μL感受態細胞中的量為80-100ng,據此確定加入TE的量】,一般為(1μg質粒加20μLTE;2μg質粒加50μLTE;5μg質粒加100μL?TE)
  • 將質粒與TE混勻,吸取2μL混液與感受態細胞混勻
  • 將感受態細胞放入冰箱(4℃)中,30min
  • 取出后立即放入水浴鍋中(42℃),熱激90s,
  • 再次放入冰箱(4℃)中,3min
  • 拿出后取200μL的LB液體培養基加入到已轉入質粒的感受態細胞中
  • 放入搖床(37℃;??195r)?中,??30nim至60min;?(最佳45min)
  • 取出離心(3000r/min;2min)
  • 去掉200μL的上清,留100μL左右上清懸浮沉淀,吸取50μL懸液涂平板,【先將對應抗性的平板放入培養箱(37℃)中預熱20min】
  • 把平板放入培養箱(37℃),過夜(12h至16h)

2. ?表達鑒定第二天的任務,注意Pcold表達載體的表達溫度

  • 每個平板挑取單菌落至4支對應抗性的LB(4ml)試管中,編號為“0”“1”“2”“3”
  • 將試管放入搖床(37℃;195r)?中,【單抗性3h左右;雙抗性4左右;剛開始用可見分光光度計測OD值;熟練后可目測(背光下,以試管中的槍頭為例,剛剛看不見槍頭即可)】,測OD值(0.6至0.8)
  • 從“0”號管中取700μL懸液加入到100μL(C=80%)的保種甘油中,震勻,放入冰箱(-20℃)凍存
  • 在每組菌的“1”“2”“3”號試管中分別加入2μL的IPTG【終濃度0.5mM最適,可根據日后表達摸索】
  • 視不同的載體選擇適合的表達環境【PET/PGEX:15℃表達過夜;25℃表達6h;37℃表達3h至4h(4支試管,“0”“1”號試管15℃表達過夜;“2”“3”試管37℃表達3h至4h)。Pcold:【全部15℃表達過夜】

3. 表達鑒定第三天,全菌的表達鑒定分析,注意控制溶質的量及溶液黏度

  • 從每組4支的試管中均取500μL菌液加入到1.5ml離心管中,【若OD值不一樣,值小的可多取】離心(6000r/min),5min,?去上清,留沉淀【沉淀少的,可再取菌液離心,盡量使沉淀量接近】
  • 在每個離心管中加入500μL的DDH2O,懸浮沉淀,離心(6000r/min),5min,?去上清,留沉淀
  • 在每支離心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading?Buffer懸浮沉淀【當溶質適量且均一的情況下,加入量不變;當溶質多且粘稠時,應使加入量增大,為降低粘度也可減少上液量】
  • 放入煮樣器(100℃)?25min
  • 取出后離心(6000r/min)??3min, ?電泳檢測。
  • 蛋白表達量不錯,進行蛋白純化;蛋白表達量低或者沒表達,可參考原核表達FAQ相對應解決方案解決。

4. 蛋白純化:見蛋白純化專題

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