噬菌體展示

噬菌體展示技術(phage display technology)的本質是一種篩選技術。下載將不同的外源基因分別插入噬菌體載體中,隨著噬菌體的傳代,外源蛋白會展現在噬菌體表面,形成噬菌體文庫。隨后用特定蛋白對噬菌體文庫進行篩選,便可快速的得到與該蛋白具有高度親和力的抗體。篩選出的抗體可以進一步用于生物學功能研究。

噬菌體展示技術原理

噬菌體展示技術的原理,是將一段外源基因插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置,在閱讀框正常且不影響外殼蛋白正常功能的情況下,外源基因會隨著外殼蛋白的表達而表達,從而使多肽或蛋白以融合蛋白的形式展現在噬菌體表面。
噬菌體展示原理

圖1.噬菌體展示原理

被展示的蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性,有利于靶蛋白的結合,因而可以利用靶蛋白快速的進行噬菌體展示抗體庫的篩選。在展示文庫構建完成后,以靶蛋白為固定相,和展示文庫共同孵育一段時間,洗去未結合噬菌體,再以競爭受體洗脫吸附的噬菌體。洗脫得到的噬菌體感染宿主菌繁殖擴增,然后進行下一輪洗脫。經過3~5輪的“吸附-洗脫-擴增”后(對于某些親和力弱的抗體需經過更多輪的洗脫),便可以得到能與靶蛋白特異性結合的噬菌體的高度富集。
噬菌體文庫淘選流程

圖2. 生物淘洗法篩選噬菌體展示文庫

篩選得到的高度親和力的噬菌體集合中可能含有多個克隆,可以利用ELISA或Westen Blot進一步對得到的外源蛋白進行篩選,或對蛋白進行鋪盤分離單克隆菌株,從而得到特異性的單克隆抗體,進而進行生物學方面研究。

噬菌體展示技術與其他抗體制備方法對比

免疫血清 雜交瘤技術 噬菌體展示技術
抗體形式 多克隆抗體 單克隆抗體 單克隆基因重組抗體
宿主細胞 N/A 雜交瘤 細菌
篩選范圍 N/A ~103 107-109(免疫庫)
操作 簡單 復雜 相對簡單
免疫 必須 必須 可避免
時間 數月 數月 幾周
人源化抗體
生產量 有限 有限 無限
基因獲取 N/A 再克隆 直接獲取
應用前景 有限 有限 廣闊

表1.不同抗體制備方法比較

噬菌體展示系統

單鏈絲狀噬菌體(M13)展示系統

絲狀噬菌體是一種能夠感染陰性細菌的病毒大家族。他們都含有單鏈DNA基因組,其衣殼蛋白為管狀,通常由幾千個拷貝的主要衣殼蛋白(PⅧ)和位于尾端的次要衣殼蛋白(PⅢ)組成。
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圖3. 絲狀噬菌體結構

PⅢ展示系統:PⅢ是絲狀噬菌體的次要外殼蛋白,位于病毒顆粒的尾端,是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個病毒顆粒都有3個~5個拷貝PⅢ蛋白,其在結構上可分為N1、N2和CT 3個功能區域,這3個功能區域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中N1作用于E.coli細胞膜上的TolA蛋白,與噬菌體入侵有關;N2為受體結合區,負責結合F菌毛;CT疏水區在組裝前粘附在細菌內膜上,與噬菌體組裝中止有關。PⅢ有2個位點可供外源序列插入,當外源的多肽或蛋白質融合于PⅢ蛋白的信號肽(SgⅢ)和N1之間時,該系統保留了完整的PⅢ蛋白,噬菌體仍有感染性;但若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結構域相連,則噬菌體喪失感染性,這時重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達的完整PⅢ蛋白來提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解,所以有輔助噬菌體超感染時,可以使每個噬菌體平均展示不到一個融合蛋白,即所謂“單價”噬菌體。
PⅢ蛋白結構域

圖2. PⅢ蛋白結構域及其功能

PⅧ展示系統:PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白,位于噬菌體外側,C端與DNA結合,N端伸出噬菌體外,每個病毒顆粒有2 700個左右PⅧ拷貝。PⅧ的N端附近可融合五肽,但不能融合更長的肽鏈,因為較大的多肽或蛋白會造成空間障礙,影響噬菌體裝配,使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時,可提供野生型PⅧ蛋白,降低價數,此時可融合多肽甚至抗體片段。

PⅢ PⅧ
拷貝數
展示蛋白 單價展示 多價展示
多肽片斷大小 <10個氨基酸
親和力
適用范圍 常用于展示有cDNA和基因組序列編碼的多肽,范圍較廣 展示小肽,范圍較窄

表2. PⅢ展示系統與PⅧ展示系統比較

λ噬菌體展示系統

PV展示系統:λ噬菌體的PV蛋白構成了它的尾部管狀部分,該管狀結構由32個盤狀結構組成,每個盤又由6個PV亞基組成。PV有兩個折疊區域,C端的折疊結構域(非功能區)可供外源序列插入或替換。λ噬菌體的裝配在細胞內進行,故可以展示難以分泌的肽或蛋白質。該系統展示的外源蛋白質的拷貝數為平均1個分子/噬菌體,這表明外源蛋白質或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。

D蛋白展示系統:D蛋白的分子質量為11 ku,參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。低溫電鏡分析表明,D蛋白以三聚體的形式突出在殼粒表面。當突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時,可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝,故D蛋白可作為外源序列融合的載體,而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。病毒顆粒的組裝可以在體內也可以在體外,體外組裝即是將D融合蛋白結合到λD-噬菌體表面,而體內組裝是將含D融合基因的質粒轉化入λD-溶源的大腸埃希菌菌種中,從而補償溶源菌所缺的D蛋白,通過熱誘導而組裝。該系統有一個很好的特點,噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制,這對于展示那些可以對噬菌體裝配造成損害的蛋白質時特別有用。

T4噬菌體展示系統

T4噬菌體展示系統的顯著特點是能夠將兩種性質完全不同的外源多肽或蛋白質,分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC(9 ku)和HOC(40 ku)融合而直接展示于T4噬菌體的表面,因此它表達的蛋白不需要復雜的蛋白純化,避免了因純化而引起的蛋白質變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細胞內裝配,不需通過分泌途徑,因而可展示各種大小的多肽或蛋白質,很少受到限制。同時,SOC與HOC蛋白的存在與否,并不影響T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌體組裝時可優于DNA的包裝而裝配于衣殼的表面,事實上,在DNA包裝被抑制時,T4是雙股DNA噬菌體中唯一能夠在體內產生空衣殼的噬菌體(SOC和HOC也同時組裝)。因此,在用重組T4做疫苗時,它能在空衣殼表面展示目的抗原,這種缺乏DNA的空衣殼苗,在生物安全性方面具有十分光明的前景。

T7噬菌體展示系統

T7噬菌體是20世紀90年代末期建立的一種新型噬菌體展示技術。T7噬菌體是一種含有雙鏈絲狀DNA的烈性噬菌體,其衣殼蛋白一般又10A和10B兩種形式。外源基因插入的位置一般位于10B蛋白的C端,這樣好處有兩點,一方面C端結合空間位阻小;另外一方面,C端的蛋白較晚被翻譯,即使是外源蛋白質的編碼基因中含有終止密碼子,也不影響與其N端融合的10B蛋白的完整表達。與M13系統相比,T7噬菌體直接使宿主菌進行裂解,因而不需經過分泌過程。因此,對于那些對分泌過程有抑制作用的蛋白和多肽,在M13系統不能很好的展示,但是可以在T7系統中展示。除此之外,T7噬菌體優勢有:

  • 生產非常迅速,在固體培養基上形成噬菌體只需3h,在菌液中從感染到裂解只需1~2h,可以節省大量的時間;
  • 對于>50個氨基酸的多肽,T7噬菌體可以在不需要輔助噬菌體的情況下進行包裝。
  • 可高拷貝數展示約50個氨基酸的多肽片段(450/噬菌體),可中拷貝數展示900~1200個多肽片段(5~15/噬菌體),可低拷貝數展示900~1200個氨基酸的多肽片段(0.1~1/噬菌體)
  • T7噬菌體在高PH值、高鹽、變性劑(100 mmol/L DTT)等條件下十分穩定,可根據不同需要采用多種條件進行篩選,并能在篩選后仍然保持很高的篩選活性。

噬菌體展示應用

噬菌體展示技術擁有諸多優勢,它實現了蛋白/多肽基因型與表型的統一,在蛋白質與其遺傳基因之間建立了直接的物理聯系;可以快速的篩選得到所需抗體;通過這項技術不僅可以篩選到一般抗原的特異性抗體,也可以產生非免疫原性或毒性抗原的抗體,能夠產生具有識別功能的人抗體,如scFv、Fab、雙功能抗體,及三價四價抗體等。所得到的抗體可以是Fab、scFv,也可以進行抗體工程改造,轉變成其他形式的小分子抗體、免疫毒素、靶向細胞因子或全抗體等,應用廣泛;相較于免疫動物生產單克隆抗體,利用噬菌體展示技術生產單克隆抗體,生產快速,操作簡便,效率更高,且可以進行人源化抗體的生產,具有更高的利用價值。

經過多年的研究與發展,噬菌體展示技術已成為一門綜合了多個學科理論、方法及策略的前沿技術,在免疫學、分子生物學、基因功能組學和新藥研究等領域發揮著不可替代的作用。下面列出了各個噬菌體展示系統的一些應用案例:

噬菌體展示系統 應用案例
M13噬菌體展示系統 PⅢ蛋白:N端展示蛋白酶抑制劑、神經末梢集合多肽、抗白色念球菌短肽,抗體特異性Notch受體蛋白、識別MBP的sAHs等,C端展示研究蛋白相互作用。
PⅧ蛋白:C端展示研究分子間相互作用
λ噬菌體展示系統 D蛋白:C端構建全基因組展示文庫研究新型肺炎支原抗體、抗原、研究蛋白質相互作用。
T4噬菌體展示系統 SOC蛋白:C端和N端高拷貝展示碳疽熱毒素。
HOC蛋白:碳端和N端展示HIV病毒p24蛋白。
在HOC的N端和SOC的C端雙位點展示豬瘟疫苗、隨機肽庫分析gp17和gp55相互作用
T7噬菌體展示系統 10B蛋白:C端構建隨機肽展示文庫、ORFs cDNA展示文庫及篩選磷脂酰絲氨酸結合蛋白

表3. 各個噬菌體展示系統的應用案例

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