蛋白不表達、蛋白表達量低原因分析

下載
原核表達(這里是指大腸桿菌表達系統)是目前常用的重組蛋白表達方式之一,操作相對簡便,要求較低。相對哺乳動物表達系統更加經濟節約。但是也常常遇到一些問題,比如原核表達蛋白表達量低?蛋白不表達?蛋白表達不在上清易形成包涵體等情況。本文主要根據實驗經驗總結原核蛋白表達的兩個問題蛋白為什么不表達和蛋白表達為什么不在上清,并提出針對性的解決方案,幫助我們提高實驗的成功率。原核表達FAQ主要內容如下;

蛋白表達為什么不在上清?

蛋白在大腸桿菌中的表達部位

細胞質中、細胞周質中、細胞外。細胞周質
蛋白在細胞周質中表達:
細胞周質是指革蘭氏陰性菌中、位于內膜和外膜之間的結構部分。周質中表達的蛋白質,分離純化簡單,而且周質中的氧化環境有利于蛋白質的正確折疊,但是蛋白產量很低。
蛋白在胞外表達:
胞外分泌是使大腸桿菌中的外源蛋白分泌到培養基中。
途徑:

  • 用大腸桿菌細胞固有的途徑,使真正屬于分泌的蛋白直接分泌到胞外培養基中。大腸桿菌在正常情況下只有極少的蛋白可以分泌到胞外,且不是特別有效。
  • 誘導大腸桿菌細胞的外膜發生有限的滲漏,從而使細胞內的蛋白向胞外培養基中分泌。

蛋白的分泌表達優點

1、一些可被細胞內蛋白酶所降解的蛋白質分泌到周質或培養基中可增加其穩定性;

2、有些在細胞內表達時無活性的蛋白分泌表達時能夠按適當的方式進行準確折疊,增加到蛋白的活性;

3、 由于蛋白質信號肽和編碼序列間被切割,所以分泌蛋白產物不含氨基酸起始密碼子ATG所編碼的甲硫氨酸,而甲硫氨酸會影響許多蛋白的活性。

蛋白在細胞質中表達

胞內表達是外源蛋白在大腸桿菌中主要的表達形式。但是由于大腸桿菌的細胞質環境呈現還原性,不利于蛋白二硫鍵的形成和穩定,從而導致蛋白的不準確折疊,形成不溶性的包涵體。
蛋白質動力學模型研究表達:活性蛋白的產率還取決于蛋白的合成速率,折疊速率和聚集速率,當外援蛋白的大腸桿菌中高效表達時,一旦形成新生肽鏈的聚集速度超過他的折疊速率就會導致包涵體的形成。

如何提高蛋白的可溶性?

重組蛋白在大腸桿菌中大量表達時,很容易在胞內形成不可溶的包涵體,為后期的純化、復性帶來麻煩,而且復性所得到的蛋白活性很低甚至沒有活性。因此,提高重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達是十分必要的。

可溶性策略

選擇合適的宿主細胞

重組蛋白在大腸桿菌中表達很難準確折疊的主要原因是大腸桿菌的細胞質環境呈現還原性,不利于二硫鍵的形成。針對這一原因,研究人員對細胞內表達主要還原途徑的兩個關鍵酶的基因進行突變,構建了有利于二硫鍵形成,蛋白準確折疊的感受態細胞,如:Origami(DE3),Origami B(DE3),Rosetta-gami(DE3),Shuffle等。

與分子伴侶共表達

分子伴侶

分子伴侶是一種幫助多肽鏈形成正確三維結構的蛋白質,它主要組織或校正出現不合理的疏水結構來幫助肽鏈的折疊。大腸桿菌內蛋白的折疊主要由兩個分子伴侶系統負責。一個系統主要含有3個分子伴侶蛋白Dnak、Dnaj和GrpE,Dnak與新合成的蛋白質結合:Dnaj和GrpE是輔助分子伴侶,Dnaj通過水解與Dnak結合的ATO促進Dnak與底物結合,GrpE催化ADP和ATP轉換釋放出底物。

另一個系統包括GroEL和GroES,GroEL是分子伴侶,而GroES是輔助分子伴侶。根據蛋白表達特點選擇合適的分子伴侶和重組蛋白共表達,可有效的提高蛋白的可溶性,但對于一些比較難折疊的蛋白,有時在分子伴侶的幫助下其可溶性也得不到改善。

采用融合標簽表達

融合標簽用于檢測和純化目的蛋白,有時也通過增加目的蛋白在細胞質中的可溶性或幫助將目的蛋白轉運到細胞周質中以提高目的蛋白的生物活性。在原核表達載體或蛋白序列中常添加一些可溶性標簽,如GST,NusA,MBP,Sumo等,這些標簽在宿主中表達的蛋白質會有高度的可溶性,在與外源蛋白質融合后,從而促進外源蛋白的可溶性表達。

選擇合適的質粒載體

降低蛋白的合成速率除了改變誘導條件,還可以通過更換弱啟動子來調節。pET系列載體有T7/T7lac強啟動子,提高了重組蛋白的表達量,但是也增加了形成包涵體的概率。為了提高蛋白的可溶性表達,我們可以選擇讓弱啟動子或帶有融合標簽的載體,如pCold、pBAD、pGEX等,這些載體在重組蛋白表達上可一定比例的提高蛋白的可溶性。

分泌型表達

分泌型表達通過將外源基因融合到編碼原核蛋白信號肽序列下游就能實現。選用分泌型表達載體,將蛋白輸出到細胞周質中,如pET20/22等。

優化培養條件

當重組蛋白高效表達時,新生肽鏈的聚集速率一旦超過蛋白的折疊速率,此時,蛋白就會以包涵體的形式在細胞內形成。所以,降低蛋白的合成速率可一定程度上的改善重組蛋白的可溶性;

降低蛋白的合成速率有很多途徑,對于固有的質粒載體來說,通常采用降低誘導溫度和誘導劑濃度的方法。為了提高蛋白可溶性的同時保證蛋白的表達量,我們可以對不同溫度梯度和誘導劑不同濃度梯度進行實驗設計,從而得到最佳誘導表達條件。

培養基的組成對提高蛋白的可溶性也有一定的影響,減少培養基中的營養成分(如,將TB換成LB),或向培養基中 添加一些物質(如葡萄糖,鎂離子,氯化鈉,硫酸銨等)。

蛋白為什么不表達?

真核基因在原核細胞中的的特點

  • 使用原核啟動子

原核細胞RNA聚合酶能識別真核基因啟動子。

  • 真核基因要置于原核載體SD序列后

從真核DNA轉錄的mRNA缺乏結合原核核糖體的SD序列,不能啟動翻譯過程。

  • 使用cDNA

真核基因中含有內含子,而原核細胞缺乏轉錄后加工體系,mRNA中內含子不能切除,不能形成成熟的mRNA,也就不能表達真核蛋白。

  • 表達無需糖基化等修飾的蛋白

原核細胞缺乏真核細胞所特有的蛋白翻譯后的修飾系統,不利于表達需要糖基化、磷酸化修飾才有活性的真核蛋白。

  • 真核基因必須切除信號肽序列

蛋白具有信號肽序列的真核基因在真核細胞內先表達成蛋白前體,在其穿越細胞膜向外分泌時,會被細胞膜上信號肽識別序列切除而分泌到細胞外。但是在原核細胞內表達時,不但影響蛋白的表達,同時由于大腸桿菌缺乏加工處理體系,不能正確切除信號肽,而表達的分泌蛋白的前體沒有實物活性,常聚集在胞內。

影響原核表達的因素

1、翻譯起始位點

現在大部分的表達載體都提供起始位點,所以它已經把起始密碼子與核糖體結合位點的距離進行了優化,一般情況下不需要自己再添加,不過還是要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子。

2、GC含量

表達序列中的GC含量超過70%的時候可能會降低蛋白在大腸桿菌中的表達水平。

3、mRNA二級結構

在起始密碼子附近的mRNA二級結構可能會抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產生不完全的蛋白。

4、密碼子的偏愛性

如果外源基因密碼子的使用頻率和宿主菌高效表達的基因密碼子的使用頻率差異較大,翻譯時核糖體在稀有密碼子處就會產生停頓,這不僅降低蛋白質的合成效率,導致新生肽鏈的錯誤折疊而影響延伸,甚至會停止翻譯。

5、質粒載體的選擇

構建質粒載體時,要考慮質粒上的元件包括啟動子,多克隆位點,終止密碼子,融合標簽,復制子,篩選標記基因等因素。

6、基因或者蛋白的大小

一般來說小于10kd和大于100kd的蛋白都是難以表達的。

7、外源基因對宿主有毒性

外源基因在宿主內會抑制宿主菌的生長甚至導致宿主死亡,表觀的現象:宿主菌在誘導后菌體量上升緩慢或不在生長。

8、基因突變(移筐突變)

堿基的突變、插入或缺失對閱讀框的影響,可能會導致表達的蛋白質結構改變,或蛋白質合成過早終止。

9、培養誘導條件

培養基成分(C/N)及培養條件(溫度、誘導時機、誘導劑,濃度、誘導時間)也是影響蛋白表達的。

解決方法

1、 更換宿主菌

稀有密碼子補給:BL21 Condon plus (DE3)、Rosetta是為了表達真核蛋白而特別設計的,它含有大腸桿菌稀有的密碼子tRNA,包括AUA,AGG,AGA,CUA,CCC和GGA。它們以氯霉素抗性的質粒形式存在。
毒性蛋白:包含pLysS質粒的宿主菌達到穩定期時溶菌酶表達水平較高,而目的蛋白表達水平降低,有效緩解蛋白對宿主帶來的影響,也可降低蛋白的表達水平,緩解蛋白對宿主的毒性。

2、 轉化菌株進行基因測序

確定基因序列的準確性,查看是否存在突變,截短等。
3、 全菌樣品做Western blot

4、 搖TB,小試純化(選擇高溫誘導)

5、 更換培養基嘗試

有的在LB中不表達,換TB或2*YT則會表達

資料鏈接:

 

僅供科研

聯系我們

電話:(025)5889-4959

咨詢:[email protected]

地址:南京市高新開發區星火路10號

蘇ICP備14041760號

平特精版料